A CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), azaz „halmozottan előforduló, szabályos közökkel elválasztott palindromikus ismétlődések” az utóbbi évek egyik legígéretesebb génszerkesztési eljárása, amely gyökeresen átalakíthatja a genetikai betegségek kezelését és a tudományos kutatást.
A technika alapját a baktériumoktól tanultuk el, melyek azonos nevű DNS-szakaszaik és Cas fehérjéik segítségével képesek felismerni a szervezetükben megjelenő idegen nukleinsavakat - vagyis a támadó kórokozók nyomait. A szakértők ezen rendszerrel rendkívül pontosan tudnak DNS- és RNS-szakaszokat törölni vagy beilleszteni.
A CRISPR/Cas rendszer működése és felfedezése
A CRISPR/Cas rendszer a prokarióták védekezési módszere a vírusok és káros plazmidok ellen; valójában egyfajta immunrendszer. A Cas fehérjék a CRISPR-ek közötti helykitöltők alapján felismerik a baktériumsejtbe behatoló idegen nukleinsavakat és darabokra vágják őket.
Az ismétlődő szakaszokat egymástól függetlenül három kutatócsoport is felfedezte. 1993-ban a Mycobacterium tuberculosis-t tanulmányozó holland csoport, valamint a Haloferax mediteranii ősbaktériumot kutató spanyolországi Alicante fiatal doktorandusza, R. Mojica, illetve 1997-ben a holland Ruud Jansen az Escherichia coli-ban talált CRISPR-jellegű szekvenciát. 2005-ben három kutatócsoport egymástól függetlenül kimutatta, hogy az ismétlődések közötti helykitöltő szakaszok bakteriofágokból és egyéb extrakromoszomális nukleinsavakból (pl. plazmidokból) származnak. Erre az első bizonyítékot a dán élelmiszeripari cég, a Danisco kutatói (Barrangou, Horvath és mások) szolgáltatták 2007-ben.
A CRISPR ismétlődő szakaszok 24-48 bázispár hosszúak. Nem teljes mértékben palindromok, de vannak bennük fordított szimmetriájú szakaszok, ami miatt feltételezhető, hogy hajtűszerű másodlagos struktúrát vesznek fel. Ezeket az ismétlődéseket hasonló hosszúságú helykitöltő szakaszok választják el egymástól.
A CRISPR-Cas rendszernek két formája ismert: az 1. osztályba tartozók esetében több Cas fehérje alkot komplexet az idegen nukleinsavak lebontására, míg a 2.-ban egy nagy protein szolgál ugyanerre a célra. Az 1. osztályban találhatóak a I., III. és IV. típusok; a 2. osztályban pedig a II. és V. típusok.
Amikor a vírus megtámadja a baktériumsejtet, a védekezési folyamat első lépéseként meg kell kötni annak DNS-ét és egy részét be kell illeszteni a CRISPR-szekvenciák közé, mint helykitöltőt. Ezt a Cas1 és Cas2 fehérjék végzik; kísérletekkel kimutatták, hogy ezeknek a hiánya meggátolja az új immunitás megszerzését, míg a régiek esetében az idegen nukleinsav lebontása továbbra is folytatódik.
Egy ismételt fertőzés esetén a Cas bontóenzimek a helykitöltőkről másolt CRISPR-RNS (crRNS) segítségével ismerik fel a célpontot. A crRNS a teljes CRISPR-régió lemásolásával keletkezik, amelyet aztán a Cas enzimek darabolnak fel megfelelő méretű szakaszokra. A II. típusú rendszernek erre a célra egyetlen, multifunkcionális fehérjéje van, a Cas9. A Cas9 maga hordozza a crRNS-t és az endonukleáz doménja végzi a behatoló genomjának semlegesítését.
A génszerkesztés elmélete és gyakorlata
A CRISPR rendszer alkalmas arra, hogy sejten belül konkrét helyeken mutációkat hozzanak létre a genomban. Erre a célra általában a II. típus a leginkább alkalmas, ahol egyetlen enzim (a Cas9) végzi az összes feladatot, a DNS-vágó enzim is az. A fenti komponenseket többnyire egyetlen plazmidban helyezik el, amelyet aztán bevisznek a célsejtbe. A CRISPR/Cas9 rendszer viszonylag egyszerű és igen nagy pontossággal végzi a feladatát. A célszekvencia általában 20 bázispárból áll. A megkötés annyi, hogy egy PAM-hoz közel kell lennie, amit a Cas9-nek önállóan (az RNS-komponens nélkül) is fel kell ismernie. Ez nem jelent komoly limitációt, mert a PAM-ok rövidek és gyakran előfordulnak. A rendszer az adott ponton egyszálas vagy kétszálas vágást produkál a genom célszakaszán. Ennek hatására beindul a sejt DNS-javító mechanizmusa, amelynek feladata a hasonló törések reparálása. A pontos javításhoz szüksége van egy templátra, egy olyan DNS-szakaszra, amely komplementer a javítandó résszel. A génsebészeti lehetőségeken kívül kísérletek folynak módosított Cas9 enzimekkel, amely elvesztette DNS-vágó képességét, de a kötőképessége megmaradt.
De mi is az a CRISPR-Cas9? Animált bevezetés a génszerkesztésbe. #valami2
Az emberi embriók génszerkesztése és etikai vonatkozásai
A CRISPR-Cas9 egyik legvitatottabb felhasználási területe az emberi embrió DNS-ének módosítása. Az emberi embriók génszerkesztésének megítélése minden, csak nem ellentmondásoktól mentes.
Korai kísérletek és aggályok
Öt évvel ezelőtt módosították az első emberi embriókat laborban, de az elmúlt években csak kevés kutatócsoport kezdett ilyen kísérletekbe. 2015-ben kínai kutatók életképtelen humán embrióban kijavították a béta-thalasszémiát okozó mutációt; cikküket azonban a Nature és Science tudományos folyóiratok etikai okok miatt visszautasították. A szakértők először hajtottak végre génszerkesztést emberi embriókon az Egyesült Államokban. A kísérlet részleteiről eddig keveset tudni, de az MIT szerint a kutatásban zigóták DNS-ét módosították a CRISPR segítségével. Fontos megemlíteni, hogy a szakértők csak néhány napig hagyták fejlődni az embriókat, és később egyet sem ültettek be emberi méhbe. Az Egyesült Államok Kongresszusa az Egészségügyi és Humánszolgáltatási Minisztérium javaslatára korábban betiltotta, hogy az ország területén genetikailag módosított embriókból magzatokat fejlesszenek.
Bár a CRISPR-et már jó pár éve ismeri a tudomány, még mindig van mit tanulnunk erről az új technikáról. A módszer számtalan etikai kérdést vet fel, ráadásul egy kutatócsapat a közelmúltban arra jutott, hogy az eljárással nem várt mutációk születhetnek.
Egy humán embriókon végzett tanulmány szerint a nem célzott mutációk kizárólag az exon régiókban fordulnak elő, így a mutációk száma jóval magasabb lehet, mint gondoltuk. Továbbá, egyes módosítások öröklődhetnek a jövő generációira is. Emiatt a tudósok úgy gondolják, hogy a CRISPR-Cas9 segítségével ki lehetne vonni a betegségeket okozó géneket a populációból.
Az is aggodalomra ad okot, hogy a lehetséges mellékhatások előre nem jelezhetők, és a következmények sem ismertek pontosan. Az ellenőrzések csak egy kis sejtcsoporton végezhetők el. Ez a korlát azt eredményezi, hogy a génszerkesztés hatásai az embriók esetében ismeretlenek és megakadályozhatatlanok maradnak a születésig.
A 2018-as kínai ikerpár esete
2018-ban egy kínai tudós, He Jiankui világszerte felháborodást keltett, amikor bejelentette, beavatkozásával megszülettek az első génszerkesztett csecsemők. A bejelentésre azonnali és széleskörű elítélés volt a válasz. A tudományos közösség tagjai szerint a technológia még túl új volt ahhoz, hogy emberi reprodukcióban alkalmazzák, és a módosítás valójában genetikai javítást jelentett.
A kínai tudós a CRISPR-rendszer alkalmazásával belenyúlt egy ikerpár génkészletébe. Az embriók génszerkesztése állítása szerint immunissá tette a HIV‑pozitív apától származó gyerekeket az AIDS betegség vírusával szemben, arra ugyanakkor nincs garancia, hogy ez tényleg így van, illetve hogy a változás nem okoz egyéb nem várt hatást. A munka a tudományos közösségben óriási felháborodást váltott ki, a kutatótól saját egyeteme is elhatárolódott.
A Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetének ügyvezető igazgatója kiemeli, hogy a beavatkozás emiatt olyan kísérletnek minősül, amely ember esetében nem felel meg az általános bioetikai normáknak. Nem engedik meg sem az országok szabályozásai, sem a nemzetközi egyezmények.
A valláserkölcsi megközelítések különbözőek, ezek nagy része pedig aggályosnak vagy eleve megengedhetetlennek tartja az ilyen jellegű beavatkozásokat. Ennek oka, hogy ilyen esetben az ember úgymond Istent játszik. A katolikus egyház tanítása ezzel együtt sem az, hogy nem szabad ilyet csinálni, hanem az, hogy csak jó cél érdekében, és megfelelő tudás birtokában szabad ilyesmire vállalkozni. Isten ugyanis elvárja, hogy az ember a keze ügyébe akadó eszközökkel megpróbáljon jót tenni. A gond viszont itt is ugyanaz: mivel nem ismerjük megfelelően a rendszert, nem tudhatjuk, hogy a beavatkozással valóban jót teszünk-e, nem tudjuk, hogy az milyen hatással lesz az érintettekre, illetve az egész közösségre. Hogy mi történik akkor, ha a gyerekek felnőnek, és családot alapítanak. Ekkor ugyanis egy mesterségesen módosított genetikai állományú szülőtől örökölnek majd módosított genetikai állományt a gyerekek. Kiemeli, hogy ennek lehet, hogy nincs kockázata, illetve olyan a kockázata, ami viselhető. Viszont nincs elég bizonyíték, hogy a rizikót kizárjuk. A magzatkori genetikai szerkesztés emiatt nem elfogadható.
Újabb kutatások és biztonsági problémák
A legutóbbi három, súlyos biztonsági problémákat felvető kutatás egyértelműen az ellenzők érveit erősítik. Itt kell megjegyezni, hogy ezek a tanulmányok még olyan frissek, hogy nem estek át a tudományos közlést megelőző lektoráláson, hanem - ma már általános gyakorlatként - feltöltötték őket a bioRxiv preprint szerverre. Ugyanakkor a legnagyobb nevű tudományos folyóiratnak számító Nature elég jónak tartotta őket, hogy hosszú cikket írjon róluk.
Az egyik mostani tanulmányt a londoni Francis Crick Intézet kutatói írták. Ebben annak a kísérletnek az eredményeiről számolnak be, amelyben génszerkesztéssel akarták módosítani az embrionális fejlődésben fontos szerepet játszó POU5F1 gént egy emberi embrióban. A tapasztalt génváltozások között voltak, amelyek átrendezték a DNS-szekvenciát, máshol pedig nagyon hosszú, több ezer nukleotidos szakaszok vágódtak ki véletlenül a DNS-ből.
A második kísérletet a Columbia Egyetemen végezték, ahol olyan spermiumokkal hoztak létre emberi embriókat, amelyek az EYS vakságot okozó mutációját hordozták. A génszerkesztéssel ezt a genetikai hibát próbálták kijavítani, de nagyon nem sikerült. A harmadik vizsgálat ugyanilyen eredménnyel zárult. A portlandi Oregoni Egészségtudományi Egyetem genetikusai egy másik, szívproblémákat okozó mutációt hordozó spermiummal hoztak létre embriót, majd ezt próbálták - sikertelenül - helyrehozni.
A feltételezések szerint a gyakori hibák hátterében a sejt saját DNS-javító mechanizmusai állnak, amelyeket egyébként a Crispr-Cas9 is használ. Miután a molekulakomplex elhasítja - remélhetőleg - a kívánt helyen a DNS-t, a sejt javítóenzimjei befoltozzák a rést. Furcsamód, eddig inkább kisebb változásokat kerestek a génszerkesztés mellékhatásait vizsgáló kutatók, például egy-egy nukleotid pontmutációját.
Mindez nem jelenti azt, hogy az emberi embriók génszerkesztése egyszer s mindenkorra beleállt a földbe, de nagyon valószínű, hogy a terület kutatóinak jövőben még nehezebb lesz engedélyeket és kutatási támogatást szerezniük.
Személyre szabott génszerkesztés ritka betegségek ellen
A New England Journal of Medicine folyóiratban május 15-én jelent meg a Children's Hospital of Philadelphia kutatóinak cikke, amelyben egy történelmi jelentőségű gyógyászati áttörésről számoltak be: a Philadelphiai Gyermekkórház (CHOP) és a Penn Medicine kutatóorvos-csapata egy ritka genetikai rendellenességgel diagnosztizált csecsemőt első alkalommal kezelt sikeresen egy személyre szabott CRISPR alapú génszerkesztési terápiával.
A KJ monogrammal rendelkező csecsemő egy ritka anyagcsere-betegséggel, súlyos karbamoil-foszfát-szintetáz 1 (CPS1) hiánnyal született. Miután élete első néhány hónapját a kórházban töltötte, és nagyon szigorú diétára fogták, 2025 februárjában, hat és hét hónapos kora között kapta meg az első adagot a génterápiából. A kezelés eddig biztonságosnak tűnik, és a csecsemő jól fejlődik.
A CRISPR alapú génszerkesztési módszer képes lehet pontosan korrigálni az emberi genomban a betegséget okozó variánsokat. A génszerkesztő eszközök hihetetlenül összetettek, és a kutatók eddig érthető módon a leggyakoribb, több tíz- vagy százezer embert érintő betegségekre összpontosítottak, például a sarlósejtes betegségre és a béta-thalasszémiára - ezek ellen már léteznek is engedélyezett génterápiás kezelések. Viszonylag kevés betegségre alkalmazható azonban az általános génszerkesztési megközelítés, mivel nagyon sok betegséget okozó variáns létezik.
Ahrens-Nicklas és Kiran Musunuru 2023-ban kezdték el közösen tanulmányozni az egyéni betegekre szabott génszerkesztési terápiák megvalósíthatóságának koncepcióját. A ritka anyagcsere-rendellenességek területén folytatott sokéves kutatás eredményeivel szerették volna párosítani az egyes betegek kezelésére szolgáló génszerkesztési módszereket. Ahrens-Nicklas és Musunuru úgy döntöttek, hogy a karbamidciklus rendellenességeire összpontosítanak.
A szervezetben a fehérjék normál lebontása során természetes módon ammónia keletkezik. Általában a szervezetünk képes arra, hogy az ammóniát karbamiddá alakítsa, majd ezt a karbamidot a vizelettel eltávolítsa. A karbamidciklus-zavarban szenvedő gyermeknél azonban hiányzik a májból az ammónia karbamiddá történő átalakításához szükséges enzim. A hasonló betegséget okozó változatokkal folytatott többéves preklinikai kutatások után Ahrens-Nicklas és Musunuru a CPS1 KJ specifikus változatát vette célba, amelyet nem sokkal KJ születése után azonosítottak. Csapatuk hat hónapon belül megtervezte és legyártotta a lipid nanorészecskék segítségével a májba juttatott génszerkesztési terápiát, hogy kijavítsa KJ hibás enzimjét.
2025 február végén KJ megkapta az első infúziót ebből a kísérleti terápiából, és azóta 2025 márciusában és áprilisában további adagokat is kapott. A kezelés óta eltelt rövid idő alatt az egyre nagyobb mennyiségben fogyasztott étrendi fehérjét jól tolerálta, és kevesebb nitrogénmegkötő gyógyszerre volt szüksége. Bizonyos tipikus gyermekbetegségekből, például a rhinovírusból is képes volt felépülni anélkül, hogy ammónia halmozódott volna fel a szervezetében. „Bár KJ-t élete hátralévő részében gondosan után kell majd követni, a kezdeti eredményeink igen ígéretesek” - fejtette ki Ahrens-Nicklas.
A CPS1-hiányos betegeket, mint KJ-t is, általában májátültetéssel kezelik. Ahhoz azonban, hogy a betegek májátültetésben részesülhessenek, orvosilag stabilnak és elég idősnek kell lenniük, hogy egy ilyen jelentős beavatkozást el tudjanak végezni. Ez idő alatt a megnövekedett ammóniaszint a betegeket folyamatos, élethosszig tartó neurológiai károsodás veszélyének teszi ki, vagy akár halálos kimenetelűnek is bizonyulhat.
tags: #crispr #genszerkesztett #embriok